|
Описание: люминесцентный микроскоп со светодиодным люминесцентным осветителем и светодиодным осветителем проходящего света
Производитель: Carl Zeiss (Германия), производится на заводе компании Zeiss в Китае.
Место проведения апробации, основной исполнитель: МГУ им. М.В.Ломоносова (Москва), Биологический факультет, кафедра гидробиологии, лаборатория водной микробиологии, руководитель группы водной микробиологии, профессор, доктор биологических наук Ильинский В.В.
Объекты наблюдения: проходящий свет - чистые культуры морских углеводородокисляющих бактерий, культивируемые на питательных средах, люминесцентная микроскопия – бактерии из Баренцева моря, сконцентрированные на нефлуоресцирующих мембранных фильтрах Osmonics (USA) непосредственно из проб морской воды, зафиксированных формалином.
I. Оценка микроскопа проходящего света Axio Scope A1 LED
Опробованы следующие варианты препаратов:
- Живые клетки бактерий, суспендированные в воде.
- Фиксированные фломбированием клетки бактерий.
- Фиксированные фломбированием клетки бактерий, окрашенные фуксином.
Условия микроскопирования:
1. Проходящий свет, темное поле, объектив
ЕС Plan-Neofluar 100х/1,3 Oil iris >>, масло иммерсионное Olympus,
окуляры PL 10х с полем 23мм. Осветитель – светодиодный (LED).
2. Проходящий свет, фазовый контраст с объективом N-Achroplan 40х Ph2, DIC с объективами ЕС Plan-Neofluar 20х и ЕС
Plan-Neofluar 63хOil, масло иммерсионное "Olympus”, окуляры PL 10х с полем 23мм. Осветитель – светодиодный (LED).
Результаты исследований
При просмотре препаратов установлены следующие достоинства микроскопа:
- Механическая работа с микроскопом не представляет сложностей для пользователя, он легко управляется и фокусируется.
- Удобный переход от одного метода контрастирования к другому.
- Использование DIC позволяет существенно улучшить качество изображения (контраст и идентификация объектов) при просмотре живых клеток бактерий, суспендированных в воде. Правда, это имеет место только в том случае, если бактерии адсорбированы на внутренней поверхности покровного стекла и по этой причине неподвижны.
- Метод DIC так же является интересным при обзорном наблюдении (с объективом 20х).
- Использование ирисовой диафрагмы, установленной в объективе
EC Plan-Neofluar 100х >>, позволило получить эффект темного поля с числовой апертурой 0,70.
Выявленные недостатки при просмотре препаратов:
- Оптимальная интенсивность проходящего света достигается только при выводе cветорегулятора на максимум. В случае плотных препаратов света может оказаться недостаточно.
- Для просмотра с DIC таких мелких объектов, как бактерии, увеличения 63х не всегда достаточно, поэтому для этих целей необходима комплектация микроскопа методом DIC с объективом 100х.
Для документирования были использованы приведенные выше варианты препаратов бактерий. Съемка проводилась с использованием камеры Axiocam MRc5 и микроскопа с
объективами
ЕС Plan-Neofluar 100х/1,3 Oil iris >> и 63х Oil c DIC.
При работе с системой документирования установлены следующие достоинства микроскопа:
- захват изображения и передача его на компьютер реализуется
легко и быстро;
- программное обеспечение позволяет корректировать основные
параметры передачи изображения в широких пределах;
- фокусировка микроскопа устойчива и не сбивается как при смене
полей зрения, так и при переключении режимов просмотра окуляр/камера;
- качество документированных изображений фиксированных
окрашенных препаратов бактерий удовлетворительное (фото 1 и 2);
- качество документированных изображений препаратов неподвижных
живых бактерий, полученных с помощью DIC c объективом 63хOil,
хорошее (фото 3).
Выявленные при документировании недостатки:
- Контрастность изображений на мониторе при просмотре неокрашенных препаратов бактерий недостаточна для их документирования (фото 4). Увеличить контрастность
изображения на мониторе за счет увеличения выдержки не удается.
- Для документирования с применением DIC изображений таких мелких объектов, как
бактерии, увеличения 63х не всегда достаточно, поэтому для этих целей необходима
комплектация микроскопа объективом 100хOil, работающим с DIC.
Для измерения размеров бактерий была использована упрощенная версия программы AxioVision. При работе установлено, что ручные измерения крупных клеток проводятся легко, а с измерением мелких клеток появляются большие проблемы.
II. Оценка люминесцентного микроскопа Axio Scope A1 LED
Условия микроскопирования: два встроенных светодиода – LED N-white и LED 470 нм; две комбинации светофильтров – Filter set 00 и Filter set 09
Объект наблюдения: окрашенные флуорохромами препараты бактерий, сконцентрированные из воды на нефлуоресцирующих мембранных фильтрах Osmonics (USA) с диаметром пор 0,22 мкм. Для окраски бактерий нами были применены наиболее распространенные в мировой практике красители-флуорохромы акридиновый оранжевый и DAPI, работающие в разных областях флуоресценции. Первый работает в области возбуждения «синяя» с длиной волн 450-490 нм, светоделитель 510 нм, запирающий светофильтр 520 нм. Второй работает в УФ-области, возбуждение – 365 нм, светоделитель 395 нм, запирающий светофильтр 420 нм.
Предоставленные с микроскопом светофильтры и светодиоды не вполне соответствовали проводимым исследованиям. В результате, комбинация светодиодов и блоков светофильтров позволила получить видимое изображение бактерий только при использовании красителя акридинового оранжевого. Препараты, окрашенные DAPI, видны в микроскоп вообще не были. Очевидно, что при наличии ртутного осветителя с линейчатым спектром, а не с жестким выделением определенной длины волны, данная ситуация была бы разрешима.
При проведении люминесцентных исследований установлено: работать со светодиодами удобнее и проще, чем с ртутной лампой, они не нагреваются, не озонируют воздух, не взрываются, как иногда ртутные лампы, и, судя по сведениям из научной литературы, имеют срок службы на два порядка больше, чем ртутные лампы.
Выявленные недостатки: цвет объектов, окрашенных акридиновым оранжевым, не соответствовал тому цвету объектов, который обычно наблюдался при работе с ртутной лампой на микроскопе ЛЮМАМ И1 со стандартным набором светофильтров для данного красителя. Фон препарата был коричневого цвета (фото 1), хотя обычно он слабо-зеленоватый (фото 2).
Фото 1. Морские бактерии на черном нефлуоресцирующем фильтре, окрашенные акридиновым оранжевым. Съемка с микроскопа Axio Scope A1 LED
Фото 2. Обычный вид морских бактерий, окрашенных акридиновым оранжевым при стандартном наборе фильтров для этого красителя. Съемка сделана на микроскопе ЛЮМАМ И1 с ртутным источником света, объектив 90х ФЛ, фотоаппарат Canon PowerShot A620 с фотоадаптером, установленном на тринокуляре микроскопа. |
